Известно, что эритроциты человека обладают отрицательным электрическим зарядом, за счет свободных карбоксильных групп молекул нейраминовой кислоты, расположенных на мембране. Благодаря силам электрического отталкивания, отрицательный заряд мембраны эритроцитов играет определенную роль в поддержании реологических свойств крови, препятствуя спонтанной агрегации эритроцитов в кровотоке. Так, удаление части сиаловых кислот с мембраны эритроцита приводило к самопроизвольной, или легко индуцируемой крупномолекулярными белками их агрегации [6,7,10,13,14].
Наличие электрического заряда у мембраны эритроцита позволяет ему перемещаться в электрическом поле, как любым другим заряженным частицам.
Отрицательно заряженная поверхность мембраны эритроцита приводит к образованию вокруг клетки т.н. ионной атмосферы, по типу двойного слоя, состоящего из положительно заряженных ионов плазмы. Некоторая часть противоионов адсорбируется на поверхности мембраны эритроцита, образуя адсорбционный слой, другая же составляет диффузный слой. Противоионы обоих слоев находятся в динамическом равновесии. Потенциал диффузной части диэлектрического слоя называют электрокинетическим, или дзета-потенциалом [1].
Эритроцит и плазма различны по проводимости и диэлектрической константе, поэтому на границе раздела двух фаз скапливаются наведенные электрические заряды, которые стремятся уменьшить различия в электрических характеристиках частицы и среды. Такая вынужденная поляризация придает эритроциту свойства электрического диполя. Его величина очень большая в сравнении с таковой обычных диполей, образующихся на молекулах разных видов. Это объясняется большим расстоянием между противоположно заряженными концами клетки. Благодаря данному факту, электрофоретическая подвижность эритроцитов происходит очень быстро и возможно наблюдать ее в обычный световой микроскоп. Живая клетка, как правило, движется из области с большей напряженностью электрического поля в область с меньшей, против направления силовых линий [4].
Скорость движения клеток в растворе электролита под воздействием электрического поля зависит от многих факторов, среди которых: величина pH, ионная сила раствора, структура мембраны клетки, в том числе расположенные на ней вещества, температура среды и пр. От размеров и формы эритроцита, скорость его движения в электрическом поле не зависит [8,9].
Существует множество исследований, посвященных изучению электрофоретической подвижности эритроцитов. Так, было показано, что удаление части сиаловых кислот с поверхности эритроцита приводит к снижению величины электрофоретической подвижности. Аналогичное явление наблюдалось при сравнении старых и молодых эритроцитов: установлено снижение электрофоретической подвижности эритроцита в процессе его старения, что может быть объяснено утратой части электрического заряда мембраны [12,15,17].
Заболевания, патологические состояния организма часто сопровождаются изменением величины электрофоретической подвижности (чаще снижение) [1,16].
Кроме прочего, было показано, что величина поверхностного заряда мембраны эритроцита может меняться, в зависимости от наличия на мембране иных, кроме сиаловых кислот, молекул [2].
Групповая принадлежность крови человека определяется типоспецифичными антигенами (гликолипидами, для системы групп крови АВО), расположенными на мембране эритроцита. Отличия в серологической специфичности определяются терминальными сахарами, прикрепленными к основной цепи. Они различны у трех антигенов: L-фукоза для антигена Н, N-ацетил-D-галактозамин для антигена А и D-галактоза для антигена В [3,5].
Структурная организация сиаловых кислот на поверхности мембраны у эритроцитов, принадлежащих к разным группам крови по системе групп крови АВО, неодинакова. Так, на мембране эритроцитов первой (О) группы крови, молекулы сиаловой кислоты располагаются диффузно, а на эритроцитах второй (А) и третьей (В) групп крови, сиаловые кислоты располагаются в виде т.н. «кластеров», с групповым антигеном на периферии или в центре «кластера», соответственно. Предполагается определенная роль подобной структурной неравномерности в патофизиологических процессах [11].
Таким образом, принимая во внимание влияние групповых антигенов эритроцитов на распределение, и, возможно, количество молекул сиаловой кислоты на поверхности мембраны, можно предположить существование определенного различия в их электрическом заряде.
Непосредственное измерение электрического заряда эритроцита представляется очень неординарной задачей, ввиду малого размера клеток и своеобразной геометрии их поверхности. Поэтому, для определения различия в электрическом заряде эритроцитов разных групп крови использовался метод измерения электрофоретической подвижности, поскольку дзета-потенциал пропорционален истинному заряду мембраны эритроцита.
Целью данной работы было установление различий в электрофоретической подвижности эритроцитов, принадлежащих к разным группам крови системы групп крови АВО.
Материалы и методы
Электрофоретическая ячейка
В качестве электрофоретической ячейки использовалась приспособленная для данной задачи камера Горяева. Стенки ячейки: половина средней площадки, поперечные прорези, покровное стекло. Рабочий объем ячейки, определенный по заполнению жидкостью, составил 0,0005мл. Стальные проводники, диаметром – 0,2мм располагались в ограничивающих половину средней площадки поперечных прорезях. Наблюдение электрофоретической подвижности производилось на плоскости срединной площадки.
Электрическая схема
В качестве источника электрического поля использовалась схема, состоящая из источника постоянного тока, напряжением 10В, стабилитрона на 4,2В, стальных проводников, резистора 1К5И. Благодаря использованию стабилитрона напряжение тока в области электрофоретической ячейки было постоянным, и составляло 4,2В. Выбранное значение напряжения тока определено опытным путем, как оптимальное в отношении скорости движения эритроцитов и диссоциации электролита.
Забор крови
В работе использовались образцы крови здоровых доноров, полученные с Братской станции переливания крови. для работы использовались эритроциты групп крови О, А, В, АВ, не содержащие антигенов систем резус и Kell. Забор крови осуществлялся с помощью вакуумных пробирок, объемом 5,0 мл, содержащих 3,8% раствор цитрата натрия. Дифференцировка по группам крови производилась с помощью стандартных цоликлонов производства ООО «Медиклон».
Подготовка эритроцитов
Кровь, консервированная 3,8% раствором цитрата натрия, выдерживалась сутки при температуре 4-5ºС, до разделения на фракции. Опыт проводился при комнатной температуре, на следующий день после забора крови. Эритроцитарная масса, разводилась 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:4000.
Регистрация электрофоретической подвижности
Регистрация подвижности эритроцитов производилась с помощью микроскопа Levenhuk 40L, видеоокуляра Levenhuk C310. Используемое оптическое увеличение 1:400.
Техника опыта
Полученный препарат крови, объемом 0,0005мл помещался в электрофоретическую ячейку. Фокус поля зрения микроскопа выставлялся на линии сетки площадки камеры Горяева. Таким образом, отчетливо видимые эритроциты принимались находящимися в непосредственной близости от дна камеры. Оценка подвижности в электрическом поле производилась в отношении эритроцитов, находящихся в фокусе поля зрения. Подобный выбор был продиктован минимальным влиянием на движение этой группы клеток водного тока. После включения электрической схемы, активировалась видеозапись, в файл на компьютере. Для повышения достоверности, измерение в отношении каждого образца производилось пять раз.
Фиксация результатов
Измерение пройденного эритроцитом расстояния проводилось путем сравнения их положения относительно линий сетки камеры Горяева, в двух кадрах, с интервалом в 5 секунд. Определение абсолютной величины пройденного эритроцитом расстояния производилось с помощью входящей в комплектацию микроскопа лицензированной программы ScopePhoto, для обработки изображений, счета форменных элементов. Подсчет проводился в пяти больших квадратах, каждого из пяти измерений. Всего произведено измерение скорости 400 эритроцитов, для каждой из четырех групп крови.
Статистическая обработка
Полученные значения скорости эритроцитов распределялись по интервалам, в процентном соотношении от общего количества измерений для каждой группы крови. Переходные значения скорости распределялись согласно правилу: включительно, соответственно нижнему пределу интервала. Данный тип представления результатов был выбран для удобства последующих статистических расчетов.
Частота встречаемости эритроцитов, в различных интервалах скорости электрофоретической подвижности приведена в табл. 1.
Таблица 1. Распределение эритроцитов по интервалам, в зависимости от их скорости
Достоверность полученных различий между величинами электрофоретической подвижности эритроцитов разных групп крови системы АВО оценивалась с использованием T-критерия Стьюдента для р<0,05, с использованием математических функций программы Microsoft Office Excel. Здесь: n - число степеней свободы, n = 8; m – ошибка средней величины, t – значение критерия Стьюдента, tкр = 2,3.
Результаты статистического анализа различий в электрофоретической подвижности эритроцитов разных групп крови приведены в табл. 2. Здесь представлены рассчитанные с помощью математических функций Microsoft Excel значения ошибки средней величины измерений количества эритроцитов (m) для сравниваемых пар групп крови, и t-критерия Стьюдента, вычисленного по общепринятой формуле. Для каждого интервала скоростей (группы эритроцитов, показавших при измерении соответствующую границам интервала скорость), расчет ведется раздельно. Значения t-критерия в интервалах скоростей, превышающие критическое для данного числа степеней свободы, отмечены и обозначают достоверное различие в количестве эритроцитов, набравших определенную скорость, между сравниваемыми группами крови.
Таблица 2. Статистический анализ различий скоростей электрофоретической подвижности эритроцитов
Примечания: * - достоверное различие при р<0,05; t - значение критерия Стьюдента; m - ошибка средней величины.
Результаты и обсуждение
Распределение скоростей движения эритроцитов в электрическом поле оказалось неоднородным как при сравнении разных групп крови, так и в пределах одной группы крови. Последнее, вероятнее всего, обусловлено различиями в возрасте клеток. Скорость движения эритроцитов варьировала от 3 до 8 мкм в секунду, или, в пересчете на внесистемную единицу измерения (ЭФП): от 0,71 до 1,9 мкм*см*В-1*с-1.
Таким образом, оказалось возможным разбить все полученные значения электрофоретической подвижности эритроцитов для каждой группы крови по интервалам, в процентном соотношении от общего количества измерений. Соответствующие результаты приведены в табл. 1.
С целью выявить имеющиеся различия в скоростях электрофоретической подвижности эритроцитов разных групп крови, сравнение производилось для каждого интервала скоростей, причем группы крови сравнивались попарно. Иными словами, сравнивалось количество эритроцитов каждой группы крови, достигнувших за время наблюдения определенной скорости в электрическом поле.
Как видно из табл. 2, способность эритроцитов третьей (B) и четвертой (AB) групп крови перемещаться со скоростью выше 7 мкм/с достоверно выше, чем у эритроцитов первой (O) группы крови. Также, среди эритроцитов третьей (B) группы крови, достоверно чаще встречались такие, которые способны перемещаться со скоростью более 7 мкм/с, в сравнении с эритроцитами второй (A) группы крови.
Частота встречаемости эритроцитов первой (O) и второй (A) групп крови в интервале скоростей 3-4мкм/с достоверно выше, по сравнению с частотой встречаемости эритроцитов третьей (В) и четвертой (АВ) групп крови.
Достоверных различий в электрофоретической подвижности между эритроцитами третьей (B) и четвертой (AB) групп крови, и между эритроцитами первой (O) и второй (A) групп выявлено не было.
В ходе проведенного исследования было установлено, что эритроциты разных групп крови системы АВО движутся в электрическом поле с различной скоростью. Показано, что среди эритроцитов третьей (B) и четвертой (AB) групп крови чаще встречаются клетки, развивающие скорость свыше 7мкм/с.
Как известно, скорость электрофоретической подвижности частиц в растворе электролита в немалой степени зависит от величины их электрического заряда. Таким образом, можно предполагать более высокий поверхностный заряд эритроцитов третьей (B) и четвертой (AB) групп крови, в сравнении с эритроцитами первой (О), и второй (А) группами крови.
Принимая во внимание, что электрический заряд форменных элементов крови играет определенную роль в их агрегационной устойчивости, можно допустить существование различий в функционировании свертывающей и противосвертывающей систем у людей с разными группами крови.
Выводы
- Установлено, что в общем пуле эритроцитов третьей (B) и четвертой (AB) групп крови достоверно чаще встречаются клетки, чья скорость в электрическом поле превышает 6мкм/с, в сравнении с первой (O) группой крови.
- Установлено, что относительное число эритроцитов третьей (B) группы крови, способных перемещаться в электрическом поле со скоростью выше 7мкм/с, достоверно выше, чем эритроцитов второй (A) группы крови.
- Различий, статистически значимых, между парами: первая (O) – вторая (A) группы крови и третья (B) – четвертая (AB) группы крови, не выявлено.
- Основываясь на полученных различиях в электрофоретической подвижности, можно предположить более высокий электрический заряд эритроцитов третьей (B) и четвертой (AB) групп крови, в сравнении с первой (O) и второй (A) группами крови.
- Различие в электрическом заряде эритроцитов разных групп крови может определять их различную агрегационную устойчивость в кровотоке, что влечет за собой особенности функционирования системы гемостаза.