Введение. Высокая распространенность буллезных дерматозов предопределяет необходимость совершенствования средств и технологий их коррекции [1-4]. Одним и современных способов лечения пациентов данного профиля является системное применение ретиноидов [2, 5-7]. При этом многими отечественными и зарубежными исследованиями продемонстрирована их эффективности в купировании обострений дерматозов [2, 5, 6, 8], однако существенной проблемой, затрудняющей их широкое распространение, служит их токсичность [9-11]. В то же время однозначных сведений о негативном действии данных лекарственных препаратов и механизмах его развития нет ни в отечественной, ни в зарубежной литературе. Ранее нами высказана гипотеза, связанная с преимущественным влиянием системных ретиноидов на белковые макромолекулы [9], однако она требует экспериментального подтверждения.
В последние годы показана возможность применения технологий биокристалломики для оценки токсичности различных соединений в экс-периментах in vitro и in vivo [12-14]. С другой стороны, в отношении задач дерматологии подобные методы ранее использовались лишь в единичных случаях. Следовательно, актуальной задачей является уточнение информативности оценки биокристалломного тестирования в изучении токсичности препаратов, применяемых в дерматологии.
В связи с этим целью исследования являлось исследование моди-фикации кристаллогенных свойств сыворотки крови системными ретиноидами (акнекутан, роаккутан) в эксперименте in vitro.
Материал и методы исследования. Для выполнения эксперимента использовали образцы цельной крови 23 практически здоровых доноров и 35 пациентов с акне. Биологическую жидкость от здоровых доноров получали из Нижегородской станции переливания крови.
Каждую порцию крови делили на 2 части, в одной из которых изучали кристаллогенную активность без дополнительных воздействий, а в отношении второй исследовали действие ретиноидов. Для этого в нанесенную на предметное стекло каплю биожидкости вносили аликвотный объем раствора акнекутана или роаккутана (в пропорции 1:1) в физиологическом растворе. После 10-минутной экспозиции из образцов крови выделяли сыворотку стандартным методом (центрифугированием), в которой изучали кристаллогенные свойства методом тезиокристаллоскопии, включающей параллельное исследование как собственной кристаллогенной активности биологической жидкости, так и инициаторный потенциал последней [8, 9, 15]. Высушенные микропрепараты оценивали морфологически (путем описания особенностей структуризации высушенного образца био-логической жидкости) и визуаметрически (с применением собственной системы параметров) [8, 9]. Для кристаллоскопического теста основными визуаметрическими показателями, оцениваемыми в балльной шкале, служили кристаллизуемость (отражает количественную сторону кристаллизации – плотность кристаллических элементов в фации), индекс структурности (характеризует сложность структуропостроения), степень деструкции фации (представляет собой индикатор качественной стороны процесса – правильности образования структур) и выраженность краевой зоны микропрепарата [9]. Учет результатов дегидратационной структуризации проводили через 1 сутки после нанесения биоматериала на стекло.
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.1 for Windows. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.
Результаты и обсуждение. Установлено, что введение в образцы крови практически здоровых людей растворов акнекутана и роаккутана вызывает специфичные сдвиги кристаллогенной активности биологической жидкости (рис. 1 и 2). Так, применение акнекутана способствует умеренному нарастанию индекса структурности (p<0,05 по сравнению с уровнем, характерным для кристаллизации биосреды без каких-либо воздействий), тогда как обработка крови здоровых доноров раствором роаккутана приводит к небольшому снижению данного показателя (рис. 1). В то же время оба рассматриваемых препарата оказывают единое, ингибирующее влияние на кристаллизуемость. В целом, роаккутан обладает угнетающим действием в отношении кристаллогенной активности сыворотки крови, а акнекутан – умеренным активирующим за счет укрупнения и усложнения формируемых структурных элементов.
Рис. 1. Уровень индекса структурности (ИС) и кристаллизуемости (Кр) в фациях сыворотки крови здоровых людей при введении в нее ретиноидов (здесь и далее * - статистическая значимость различий по отношению к контрольному образцу p<0,05).
Сопряженные эффекты выявлены и для степени деструкции фации, а также выраженности краевой зоны в микропрепаратах высушенной биологической жидкости (рис. 2). Обнаружено, что введение в образцы крови здоровых людей обоих изучаемых препаратов провоцирует нарастание деструктивных изменений морфологии кристаллических фигур, однако в большей степени это относится к роаккутану, для которого прирост значения соответствующего параметра составляет 107% по сравнению с контрольным образцом (p<0,05).
Напротив, диаметр краевой зоны микропрепаратов биожидкости снижается при введении в нее рассматриваемых ретиноидов, причем наиболее отчетливая редукция наблюдается при действии роаккутана. Это может быть обусловлено более выраженным негативным влиянием данного лекарственного препарата на состояние белков плазмы крови [14, 16. 17], что было показано в наших предшествующим исследованиях [8, 9].
Рис. 2. Степень деструкции фации (СДФ) и выраженность краевой зоны (Кз) в фациях сыворотки крови здоровых людей при введении в нее ретиноидов.
Таким образом, при введении в образцы здоровых людей in vitro акнекутан модифицирует кристаллогенные свойства путем усложнения кристаллических элементов, сопровождаемого умеренным нарастанием выраженности деструкции структур и размеров краевой белковой зоны, тогда как роаккутан способствует существенному угнетению кристаллогенного потенциала в комбинации с существенным увеличением степени деструкции фации и значительным сужением краевой зоны микропрепаратов сыворотки крови. Подобные изменения косвенно свидетельствуют о потенциальной токсичности рассматриваемых препаратов [9].
В рамках второго этапа экспериментального исследования изучали влияние указанных ретиноидов на дегидратационную структуризацию сыворотки крови пациентов с акне (рис. 3 и 4).
Выявлено, что микропрепараты сыворотки крови больных дерматологического профиля существенно отличаются от характерных для практически здоровых доноров, что проявляется в изменении морфологии образцов и сдвигах всех оцениваемых параметров (рис. 1-4). В частности, в кристаллоскопических фациях обследуемых пациентов регистрировали значимое угнетение кристаллогенной активности, реализовавшееся в снижении уровня индекса структурности и кристаллизуемости (p<0,05 для обоих показателей по сравнению с фациями здоровых доноров). Кроме того, в кристаллограммах биологической жидкости больных с дерматозами отмечали высокую степень деструкции элементов, а также значительное сужение краевой белковой зоны.
Рис. 3. Уровень индекса структурности (ИС) и кристаллизуемости (Кр) в фациях сыворотки крови пациентов с акне при введении в нее ретиноидов.
Введение ретиноидов частично обеспечивало нормализацию кристаллогенных свойств биологической жидкости (рис. 3 и 4). Так, растворы акнекутана и роаккутана увеличивали исходно сниженный уровень индекса структурности и кристаллизуемости (рис. 3), причем максимально данная тенденция выражена при добавлении в сыворотку крови пациентов акнекутана (p<0,05 для обоих показателей по отношению к контрольному образцу биожидкости). Следует отметить, что, несмотря на статистическую значимость указанного тренда, ни по одному из изученных параметров не достигнут уровень, характерный для практически здоровых людей.
В то же время введение растворов обоих лекарственных препаратов приводило к существенному нарастанию степени деструкции фации (рис. 4), что косвенно может свидетельствовать о наличии негативного метаболического ответа крови на применение изучаемых ретиноидов. Важно отметить, что использование роаккутана индуцирует формирование более выраженных признаков деструкции кристаллических элементов микропрепаратов, чем введение акнекутана (p<0,05).
Рис. 4. Степень деструкции фации (СДФ) и выраженность краевой зоны (Кз) в фациях сыворотки крови пациентов с акне при введении в нее ретиноидов.
Данная тенденция проявляется с обратным знаком и в отношении размера краевой зоны высушенных образцов биосреды. Указанные изменения могут отражать потенциальное токсическое действие препаратов, преимущественно реализующееся в сдвигах состояния протеома сыворотки крови.
Заключение. Таким образом, в условиях in vitro акнекутан и роаккутан специфично модифицируют кристаллогенные свойства сыворотки крови, полученной как от практически здоровых людей, так и от пациентов с акне. При этом биологическая жидкость первых лишь умеренно реагирует на введение ретиноидов, тогда как кристаллогенная активность биосреды больных дерматологического профиля демонстрирует тенденцию к частичной нормализации, более выраженную при использовании акнекутана. Следует отметить, что на основании проведенных кристаллоскопических исследований выявлены потенциальные токсические эффекты изучаемых ретиноидов, более существенные для роаккутана.